基因型

E.coli B F– ompT hsdS(rB–mB–) dcm+TetR gal λ(DE3) endA Hte [cpn10cpn60 GentR]

簡(jiǎn)要說明

ArcticExpress (DE3)來(lái)源于E. coli B，為L(zhǎng)on和OmpT蛋白酶缺陷型菌株，可促進(jìn)表達(dá)蛋白的穩(wěn)定。ArcticExpress(DE3)菌株染色體DNA中整合了λ噬菌體DE3區(qū)，使得ArcticExpress(DE3)菌株可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，廣泛用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。ArcticExpress(DE3)菌株具有四環(huán)素，qing大霉素抗性，endA1突變有利于質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定。[cpn10cpn60 GentR]的存在使ArcticExpress(DE3)可以表達(dá)適應(yīng)低溫的伴侶蛋白Cpn10和Cpn60（來(lái)自嗜冷菌—Oleispira antarctica）。Cpn10和Cpn60伴侶蛋白在4-12℃表現(xiàn)出較高活性，在ArcticExpress (DE3)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可降低重組蛋白包涵體的形成，增加可溶重組蛋白的表達(dá)量及生物活性，比傳統(tǒng)的原核表達(dá)伴侶蛋白GroEL、GroES等具有更加優(yōu)異的促融性能。ArcticExpress (DE3)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108cfu/μg DNA。

操作說明

1、ArcticExpress (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率

3. 向離心管中加入700 µl不含抗生素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

 4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 µl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上（平板中務(wù)必同時(shí)含有34µg/ml的lu霉素，40µg/ml的qing大霉素和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒本身的篩選抗生素；若質(zhì)粒濃度較高，也可稀釋后涂板，務(wù)必保證能在平板上挑到單克隆菌落）。 

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有40ug/ml的、qing大霉素，以防質(zhì)粒丟失。

3. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

4. ArcticExpress (DE3)感受態(tài)細(xì)胞具有四環(huán)素、qing大霉素抗性，不可用于具有四環(huán)素、qing大霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。